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新型冠状病毒检测为何会出现假阴性

产出机构： 上海图书馆（上海科学技术情报研究所）

提交机构： 中国科学技术信息研究所

产出日期： 2020-02-09

发布日期： 2020-02-20

作者： 蒋洁如;

摘要：

关键字： 新型冠状病毒;核酸检测;防疫战;检测方法

相信测试技术的提高、试剂盒供应量的增大、质量管控的提升以及检测效率的提高，会让核酸检测更加准确、快速，帮助医务人员更好地进行防疫治疗！

当前，新型冠状病毒感染病例进入了集中爆发期，防疫战进入了最为艰难的时刻。在整个防疫治疗的过程中，病例的确诊是至关重要的环节。但目前，却出现了多个确诊病例在检测多次之后才出现阳性，或者病毒核酸检测为阴性，而实际CT显示为肺部感染新冠病毒症状的情况。众所周知，任何检测手段都存在出现假阴性的误差，但当前，面对全新的冠状病毒，以及频频出现检测“假阴性”的报道，人们不禁猜测，是新冠病毒出现变异了吗？核酸检测真的准确吗？对此，也有医务工作者倡议用肺部CT代替核酸检测，作为新型肺炎的确诊标准，那么，肺部CT真的能取代核酸检测吗？让小编带着大家一起，探究新型冠状病毒检测方法，找出出现假阴性的可能原因。

1、什么是新型冠状病毒（2019-nCoV）？

我们先对新型冠状病毒有一个基础的认识。首先新型冠状病毒（2019-nCoV）是冠状病毒，它是RNA单链病毒。冠状病毒亚科分为α、β、γ和δ四个属，新型冠状病毒属于β属。新型冠状病毒与中东呼吸综合征相关冠状病毒MERSr-Cov、严重急性呼吸综合征相关冠状病毒SARSr-Cov一样，都会引起上呼吸道感染，可引起肺炎、甚至重症肺炎，且可人传人。但是，新型冠状病毒与SARSr-Cov和MERSr-Cov病毒在基因序列上又存在明显区别。

总之，新型冠状病毒属于冠状病毒，并且是RNA单链病毒。相较于DNA病毒，RNA病毒不稳定，具有较高的变异性。

图片来自网络

2、新型冠状病毒的检测方法和检测原理是什么？

新型冠状病毒的常规检测方法是荧光RT-PCR检测法。RT-PCR检测法是聚合酶链式反应（PCR）的一种广泛应用的变形，PCR是一种放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，通过PCR将特定的DNA片段扩增后，再通过荧光探针去检测特定的DNA是否存在。而荧光RT-PCR检测就是一条RNA链逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA片段扩增，再通过荧光探测来标定扩增的DNA片段是否存在。该方法能够检测细胞中的RNA病毒的含量。

我国国家卫健委提出的针对新型冠状病毒的检测标准，需要对病毒的多个保守目标序列上的两个目标靶点（ORFlab、N）均进行扩增检测（如图1），只有当两个都显示阳性了，才能确诊。在对新型冠状病毒进行RT-PCR检测时，德国、泰国、日本、中国均针对多个保守目标序列进行扩增检测，用多个保守目标序列进行检测，也是为了防止病毒变异导致检测结果出现假阴性。

2: 冠状病毒RT-PCR试剂盒的大致工作流程图片来源：自制

图片来自网络

数据来源：NCBI GenBank 图1.新冠病毒参考基因组

3、RT-PCR核酸检测结果真的准确吗？

原理上看，准确！从原理的角度可知，RT-PCR核酸检测方法直接能够找出人体中是否存在新型冠状RNA病毒序列，相当于直接找出了凶手，而肺部CT的影像表征仅仅呈现的是一个“犯罪现场”，凶手到底是谁并不能直接说明，可能是新型冠状病毒所致，也可能是其他病毒感染所致；因此，相较于肺部CT影像，RT-PCR核酸检测方法能直接、准确地确定病原体是否是新型冠状病毒。

那么，既然从原理上判断，荧光RT-PCR核酸检测方法理应非常准确，那为什么仍然会出现假阴性的误判呢？是否病毒的基因序列已经发生改变了呢？

假阴性并非表明病毒一定发生了变异。虽然新型冠状病毒是RNA单链病毒，相较于DNA病毒会更加不稳定，具有较高的变异性。但是，根据上述RT-PCR核酸检测原理来看，我国在检测过程中选用的是多个保守目标序列中的靶点，也就是说选取的是不容易发生变异的序列片段上的靶点。

如果不是因为病毒发生了变异而导致假阴性，那么到底是什么原因呢？

4、是什么导致了RT-PCR核酸检测结果出现假阴性？

误差很可能出在检测过程当中。RT-PCR核酸检测方法的最大特点是特异性高、灵敏度高，但最大的弱点是易受污染影响。一旦样本质量差，样本收集时间过早或过晚，没有正确地保存、运输和处理样本，就容易造成检测失败。

采样环节——根据国家卫建委的新冠病毒检测标准可知，核酸检测标本主要有上呼吸道标本（咽拭子、鼻拭子等）、下呼吸道标本（痰液、肺泡灌洗液、支气管灌洗液等）和血液标本。由于新冠病毒与普通流感病毒的明显区别在于，病人主要为干咳、无痰，所以目前的普遍采样方式为咽拭子。咽拭子的病毒含量少，再加上取样操作复杂，采样稍微不规范，就容易导致病毒载量过低而无法测出。

保存环节——标本保存的环境条件也十分严格，参照国家卫健委给出的标准（见表1）即可知。而在疫情期间，在如此大量的待测样本下，必定会存在多数样本超过24小时才得到检测，那么这些样品就需要在-70℃下才能长期保存，这么苛刻的保存条件，如果某个样本没能得到完善的保存也是在情理之中了。

表1 采样标本保存条件

保存时间	保存温度
＜24小时	4℃
≥24小时	-70℃或以下保存（备选：-20℃冰箱暂存）

数据来源：国家卫生健康委员会办公厅

运输环节——标准还规定，采集样本后应尽快送往实验室，如果是长途运输，则需要干冰制冷保藏。这也看出，病毒标本的运输并非易事。

检测环节——避免RNA酶污染也是RT-PCR检测成功的关键之一，使用的全部器皿和耐高压的试剂都必须经高压灭菌处理。操作者全程都应该戴一次性手套和口罩，以防污染。

可见，要想成功地完成一次核酸检测，并非易事。从样本采集到后续的检测，均要严格遵照实验条件，任何一个环节出错，都会导致最后结果的失败。而疫情期间，面对如此大量的待测样本，保证每个环节都不出错，难度很大。

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图片来自网络

检测试剂盒——检测试剂盒的检出率也是影响检测结果的原因之一。根据国家药品监督管理局医疗器械技术审评中心制定的《呼吸道病毒多重核酸检测试剂注册技术审查指导原则（2019年80号）》可知，检测试剂需要保证90%-95%的检出率。也就是说，存在5%-10%的可能性未检出。目前，越来越多的企业参与到病毒检测试剂盒的研发和生产队伍当中，不同生产厂家的检测试剂盒的灵敏度也参差不齐，这也会增加检出假阴性的概率。

5、目前有几家生产核酸检测盒的企业？

目前，已有6家公司的7个新型冠状病毒检测试剂盒获批，其中上海占了3家（见表2）。一些地方政府为此开辟了绿色通道，加速其他生产企业的试剂盒的获批，同时，国家药监局也在加大力量做好质量把控，为此专门配备了专业审评员，负责24小时给予受评公司问题解答。

表2 新型冠状病毒检测试剂盒供应商列表

序号	公司	产品
1	上海之江生物科技股份有限公司	新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR法）
2	上海捷诺生物科技有限公司	新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR法）
3	华大生物科技（武汉）有限公司	新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR法）
4	华大生物科技（武汉）有限公司	新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（联合探针锚定聚合测序法）及分析软件
5	中山大学达安基因股份有限公司	新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR法）
6	圣湘生物科技股份有限公司	新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR法）
7	上海伯杰医疗科技有限公司	新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR法）

此外，中国疾病预防中心病毒病预防控制所还成功研制了新型冠状病毒（2019-nCoV）核酸等温扩增快速检测试剂盒，可在8-15分钟内出结果，极大缩短检测时间，配套等温扩增仪器可自动判读结果。

6、肺部CT能够取代核酸检测吗？

面对核酸检测出现假阴性的状况，有医务人员提出用肺部CT取代核酸检测会更为快速，肺部CT手段简单，直接通过影响判断比较直观，且核酸检测目前排队等待时间长，此时肺部CT相对快速一些。

然而，单纯肺部CT在早期感染阶段，是无法有效分辨是新冠病毒感染还是普通肺炎的，并且，目前已经发现无症状的病毒携带者，这类人群是无法采用肺部CT等影像检测手段来确诊的，而荧光RT-PCR核酸检测方法能够直接确定病毒是否存在。

此外，肺部CT检测更容易造成交叉感染，在确诊者检测之后，就必须对检测机器装备进行消毒。

因此，荧光RT-PCR核酸检测仍然是必要的，有专家建议将两者结合起来看情况来使用。国家卫健委也在第五版诊疗方案中，将“疑似病例具备肺炎影像特征者作为当前湖北省中重疫区临床诊断病例标准”，也就是说将肺部CT影像作为“临床诊断病例”的判断依据。

总之，以荧光RT-PCR核酸检测为主要检测手段，辅之以肺部CT影像诊断，是较为科学合理的确诊方案！

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【总结】新型冠状病毒检测为何会出现假阴性？

1、核酸检测标本（特别是上、下呼吸道标本）的采样操作复杂，采样稍微不规范，就容易导致病毒载量过低而无法测出。

2、标本保存的环境条件苛刻，≤-70℃的长期保存条件难度大。

3、标本运输的时效性和干冰保藏条件并非易事。

4、检测过程需保障无菌环境，一旦RNA酶被污染，检测就会前功尽弃。